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Ces deux composés sont transformés en hespérétine et en naringénine dans le tube digestif.

Plusieurs métabolites ont été trouvés dans le sang des volontaires. Il s’agit pour les buveurs de jus d’orange d’hespérétine sulfatée et d’hespérétine glucuronidée et pour les buveurs de jus de pamplemousse de naringénine glucuronidée. Ces métabolites sont formés au niveau des cellules de la paroi intestinale mais aussi par les cellules du foie et celles du rein. Il s’agit de composés qui sont très solubles dans l’eau et qui peuvent donc être facilement éliminés dans l’urine. Les étapes de transformation des composés du jus d’orange en ces métabolites ont pour but de favoriser leur élimination. Il faut noter que ce sont surtout ces composés sulfatés ou glucuronidés qui sont présents dans le sang et dans la lymphe et qui sont susceptibles d’arriver jusqu’aux cellules pour y exercer une action.

Une fois ces composés identifiés ils ont pu être synthétisés par les chimistes organiciens impliqués dans le projet. Leur synthèse a également permis de lever des doutes qui pouvaient dans certains cas subsister quand à leur identification. En effet, les techniques d’analyse mises en œuvre (HPLC couplée à la spectrométrie de masse) ne permettent pas toujours d’être absolument sûr de la formule chimique des métabolites détectés en faible quantité dans les fluides biologiques. Lorsque l’on synthétise des quantités importantes de ces composés on peut procéder à des analyses chimiques plus poussées (analyse RMN du proton et du carbone 13 notamment) qui permettent d’être certain de la formule chimique exacte du composé. Les produits synthétisés sont ensuite passés en HPLC couplée à la spectrométrie de masse pour vérifier si les temps de rétention que l’on obtient avec eux sur les colonnes sont les même que ceux obtenus avec les échantillons de fluides biologique et si les spectres de masse concordent bien.

Pour un ELISA il faut un anticorps spécifique de la molécule à doser. Une molécule qui ressemble aux molécules à doser avec en plus un pont de plusieurs atomes de carbone terminé par une fonction carboxylique (COOH) a été synthétisée. C’est un haptène. L’haptène est ensuite couplé en plusieurs exemplaires à une protéine puis injecté à un lapin. Comme pour une vaccination celui-ci fabrique des anticorps contre cet édifice moléculaire. Cet anticorps reconnaîtra alors spécifiquement le polyphénol d’intérêt donc ici l’hespérétine ou la naringénine. Les deux anticorps anti-hespérétine et anti-naringénine servent à doser les composés dans des plaques de microtitration de 96 puits. Dans la même plaque on peut disposer 96 solutions différentes. On utilise certains puits pour des solutions d’une gamme de concentrations connues de polyphénols ; dans les autres puits on dépose des échantillons témoins qui permettent de fiabiliser la mesure et aussi des échantillons inconnus. L’ELISA permet de doser grâce à une réaction colorée. La couleur obtenue pour les échantillons inconnus est comparée à celles obtenues pour les solutions de gamme. Cette comparaison permet d’attribuer à chaque échantillon sa concentration propre.

Les ELISA développés et validés dans le cadre de ce projet ont permis de doser les polyphénols à la fois dans le sang et les urines des souris mises en expérimentation mais également dans le sang et les urines des volontaires de l’étude clinique. Les dosages ont donné des résultats conformes à ce qui était attendu. L’hespérétine a été retrouvée dans les fluides biologiques des volontaires sous jus d’orange mais pas dans ceux des volontaires sous boisson reconstituée sans polyphénol. Pour les souris, la naringénine n’a été retrouvée que dans les fluides biologiques des souris sous régime enrichi en naringine et l’hespérétine n’a été retrouvée que dans les échantillons prélevés sur les souris sous hespéridine. Nous avons, de la même façon, confirmé que les doses mesurées étaient du même ordre que celles que l’on retrouve dans les fluides biologiques des humains buvant des jus d’orange ou de pamplemousse. On peut donc considérer que les résultats obtenus sur les rongeurs sont relativement bien transposables à la situation humaine.

Cette étude a permis de mettre en évidence des marqueurs d’exposition. Il s’agit de métabolites générés essentiellement par l’intestin, le foie et le rein des individus exposés aux composés présents dans le jus d’orange ou le jus de pamplemousse. Ces composés sont très nombreux : plusieurs centaines, et ils n’ont pas tous été identifiés à ce jour. Pour l’instant l’identification a été faite sur les métabolites présents en quantités les plus importantes en partant du principe que ce sont sans doute ceux qui sont le plus actifs sur les cellules de l’organisme. L’étude a permis ainsi d’identifier des composés dont on ne soupçonnait pas l’existence dans les fluides biologiques des buveurs de jus d’orange ou de pamplemousse. Cela permet d’envisager dans l’avenir de nouvelles études spécifiques de l’effet de ces composés qui présenteront peut-être aussi des effets intéressants sur la santé.

Ci dessus: Exemple d’une analyse métabolomique menée sur les volontaires de l’étude clinique en rouge début d’expérience en noir après 4 semaines de prise de jus d’orange. L’analyse est basée sur les composés les plus discriminants entre les deux traitements.

Les études métabolomiques permettent également d’identifier des composés naturellement présents dans l’organisme mais dont la concentration dans les fluides biologiques est modifiée par la prise de jus d’orange ou de pamplemousse. Les variations observées pour ces concentrations indiquent cette fois un effet particulier du jus d’orange sur l’organisme. On parle alors de marqueurs d’efficacité. Certaines modifications étaient attendues car on connaissait déjà quelques-uns des effets du jus d’orange, d’autres sont surprenantes et amènent à penser que des études devraient être menées pour confirmer les effets observés.
 

Cela a permis d’examiner les effets spécifiques des phytomicronutriments du jus d’orange mais aussi, par comparaison, ceux des autres composés apportés par la boisson reconstituée. En effet, des mesures ont été réalisées au début de chaque période de test ainsi qu’à la fin de chacune d’elles. Différents marqueurs des effets antioxydants ont été mesurés. Ils montrent que les deux boissons présentent ce type d’effet et pour un des marqueurs le jus d’orange présente un effet supérieur à celui de la boisson reconstituée. Cet effet peut être attribué aux phytomicronutriments. Dans les autres cas la présence de Vitamine C dans les deux boissons peut expliquer les effets observés et combinés à la variabilité interindividuelle, ils masquent en partie les effets des phytomicronutriments. Un certain nombre d’analyse concordent. Aux doses mises en œuvre dans cette étude qui sont des doses alimentaires, le jus d’orange et plus particulièrement sa composante phytomicronutriment n’a pas eu d’effet sur les lipides et lipoprotéines plasmatiques. Enfin les phytomicronutriments du jus d’orange semblent avoir empêché la montée de la concentration d’homocystéine dans le sang que l’on observe avec la boisson reconstituée. L’homocystéine est un facteur de risque vasculaire.

Par rapport aux souris normales C57Black 6/J : les souris C57Black 6/J sous régime athérogène (riches en graisses et cholestérol) présentent un taux de cholestérol total augmenté. Les souris transgéniques ApoE -/- présentent des taux de cholestérol total très augmenté. Les souris transgéniques [HL-/- ; LDLR-/-] présentent des taux de triglycérides et de cholestérol total très augmentés. Ce dernier modèle est proche de situations pathologiques courantes chez l’homme.
Toutefois, si le premier modèle : C57Black 6/J sous régime athérogène correspond à une situation de désordres alimentaires les deux modèles transgéniques s’apparentent plutôt à des individus malades. Chez ces derniers, les effets d’un apport alimentaire de naringine ou d’hespéridine n’ont pas eu beaucoup d’effets. En revanche chez les souris normales sous régime athérogène l’apport des flavonoïdes (à doses considérées alimentaires chez l’homme) a permis d’observer plusieurs effets bénéfiques notamment avec la naringine du pamplemousse. Ainsi il a été observé : une diminution des lipides plasmatiques et une diminution des facteurs d’adhésion présents sur les cellules de la paroi des vaisseaux sanguins pouvant expliquer, du moins en partie, la moindre incidence d’un tel régime sur la paroi artérielle
Une analyse très large de l’expression des gènes induite par les traitements, fait là aussi ressortir un effet plus important de la naringine du pamplemousse que de l’hespérédine de l’orange. A partir de tissus aortiques provenant de souris traitées et de souris témoins, on observe des modifications de l’expression des gènes impliqués dans la synthèse des protéines du cytosquelette, dans la reconnaissance des protéines de la matrice extracellulaire et dans la synthèse des protéines impliquées dans les jonctions entre les cellules qui forment la paroi vasculaire. Or, le développement de la plaque d’athérome implique la migration de cellules musculaires d’une couche à l’autre au travers d’une matrice extracellulaire élastique. Ceci nécessite à la fois une modification de la forme des cellules et donc une modification de leur squelette mais aussi pour qu’elles puissent se déplacer, il faut que les jonctions entre les cellules de la paroi s’écartent et donc que leurs jonctions soient fragilisées. Certains gènes qui codent des molécules impliquées dans les processus d’inflammation (surexprimés par ailleurs chez les personnes obèses ou diabétiques) voient également leurs expressions modifiées par la consommation de naringine.

 Plusieurs paramètres doivent être suivis. Toutefois, on peut dire que les métabolites qui ont été testés n’exercent pas les mêmes effets sur les deux types cellulaires. Il semble que les cellules endothéliales soient plus sensibles aux métabolites sulfatés ou glucuronidés que les Cellules Musculaires Lisses (CML). Elles sont aussi plus directement en contact avec elles puisque directement au contact du sang. Notamment certains effets apparaissent sur l’adhésion des monocytes (une catégorie particulière de globules blancs). Ce processus est à la genèse de la formation d’une plaque d’athérome. En effet, lorsque les globules blancs se sont fixés à la paroi du vaisseau ils peuvent passer la couche cellulaire de l’endothélium et fixer les lipides pour se transformer en cellules spumeuses. Sur les CML, les deux flavanones : hespérétine et naringénine ont été testées sur des cellules issues de souris normales et de souris transgéniques [HL-/- ; LDLR-/-]. Elles ont toutes les deux inhibé la prolifération des cellules musculaires lisses mais uniquement sur les cellules issues de souris normales. La prolifération favorisant la formation de la plaque d’athérome son inhibition est donc un effet protecteur vasculaire.